【Science Advances】中美聯合開發新的胞嘧啶堿基編輯器，消除了旁觀者突變
發布時間：
2020-07-25 09:00
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研究人員表示，盡管CBE可以在目標基因座上實現有效的胞嘧啶到胸嘧啶（C-T）而沒有雙鏈斷裂，但目前的CBE在其活動窗口內編輯了所有C，產生不希望的旁觀者突變。當旁觀者C與目標C相鄰時，現有的基本編輯器將同時編輯兩個C。
??為了提高CBE的精度，研究人員將人APOBEC3G（A3G）脫氨酶工程化為三個變體，并將其與Cas9切口酶融合。所得的A3G-BE在人類細胞中的5'-CC-3'基序中表現出對第二個C的選擇性編輯，以高精度安裝與單一疾病相關的C-T取代。
??脊椎動物中的各種脫氨基酶（APOBEC酶）通過將病毒互補DNA中的C取代為U，來介導防御逆轉錄病毒或逆轉座子的感染，這表明這些胞嘧啶脫氨酶對于特定的序列基序可能具有獨特的偏好，以區分DNA序列與天然宿主。研究人員發現，人類APOBEC3G（A3G）是在多個C環境中開發序列特異性BE的候選者。他們對A3G-BE變體進行了表征和工程改造，以有效地編輯HEK293T細胞內源性位點上的單個C，最終得到三個新穎的變體：A3G-BE4.4，A3G-BE5.13和A3G-BE5.14。它們在CC基元背景下表現出較高的編輯效率和精度。
??進一步的分析表明，盡管在研究人員測試的所有位點上，A3G-BE4.4，A3G-BE5.13和A3G-BE5.14都選擇性地編輯了CC基序中的第二個C，但A3G-BE4.4顯示出對比其他兩個變體更窄的編輯窗口。進一步的測試顯示，這三個變體都具有一致且廣泛的基礎編輯活動窗口，但是它們的主要編輯效率有所不同——A3G-BE5.13最有效，其次是A3G-BE5.14和A3G-BE4.4。
??為了在與疾病相關的背景下測試A3G-BE，他們試圖精確生成已報道的人類致病性疾病的SNP。研究人員選擇了三種由C-T取代引起的遺傳變異，其中野生型序列位于A3G-BEs的優先5'-CC-3'基序內，包括囊性纖維化，高滲性肌病和運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性。他們構建了針對這些疾病相關位點的單個sgRNA，并將它們與BE4max，A3G-BE4.4，A3G-BE5.13和A3G-BE5.14共轉染到HEK293T細胞中。
??將修改的等位基因頻率與BE4max進行直接比較，結果表明，在所有三個模型中，A3G-BEs誘導的完全修飾等位基因的比例要高得多，而A3G-BE5.13在高滲性肌病中獲得了最高比例的完全修飾等位基因（36％）。對于運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性，所有A3G-BEs都能高效產生所需的等位基因（超過35％），而BE4max則無法編輯靶標C，因為它無法在其活性范圍之外進行編輯。與BE4max相比，A3G-BE5.14完成了運甲狀腺素蛋白淀粉樣變性正確模型的613倍。同樣，對于囊性纖維化，所有A3G-BEs均誘導超過50％的完美修飾等位基因，而BE4max平均為0.6％。
??研究人員還著手研究A3G-BE的治療適用性。他們選擇了三種由T> C突變引起的人類致病性SNP，它們可以優先被A3G-BE靶向，包括遺傳性焦磷酸細胞增多，囊性纖維化和全羧化酶合成酶缺乏癥。他們產生了三個HEK293T細胞系，每個細胞系包含200個堿基對，每個疾病相關序列均已整合到基因組中，并共編碼了靶向疾病相關位點的BE和sgRNA。
??他們的分析表明，在糾正遺傳性焦磷酸細胞增多癥和囊性纖維化方面，所有A3G-BEs的表現均比BE4max至少高出三倍。此外，在其他Bes中，A3G-BE4.4單獨誘導了超過50％的完全校正等位基因，并且在整體羧化酶合成酶缺乏癥方面，校正量比比BE4max高出6,496倍。
??資深作者，萊斯大學生物分子工程師薛高在一份聲明中說：“我們鑒定了540種人類病原體單核苷酸多態性，可以通過我們的A3G-BEs精確校正。它們似乎還減少了DNA和RNA水平的脫靶編輯。人類有30億個堿基對，我相信這項技術的精確水平將對治療遺傳疾病做出重要貢獻。”
??參考：
??https://www.genomeweb.com/gene-silencinggene-editing/improved-cytosine-base-editing-tech-eliminates-problem-undesired
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