“最小”的CRISPR-Cas3系統 可快速準確刪除DNA片段，編輯效率近100%

該系統稱為Cascade–Cas3，由進行性核酸酶Cas3，以及一個基于Type IC Cascade的最小系統組成，用于對細菌的基因組進行編輯。在單一CRISPR RNA的引導下，DNA切割在銅綠假單胞菌中產生了大規模刪除（7–424千堿基），效率接近100%。

        這項工作由加州大學舊金山分校（UCSF）的Joseph Bondy-Denomy博士領導，并于10月19日發表于《自然-方法》雜志，題為“A compact Cascade–Cas3 system for targeted genome engineering”。

        該Cas3系統可用來切碎Cas9片段，刪除長段DNA。而且它的精度很高，是少有的高質量大規模編輯工具。Cas3作為這一最小的CRISPR系統的一部分，結合了準確性和可變性，已高效地完成了高達424 kb的基因組刪除。

        在該研究中，科學家選擇并改良了銅綠假單胞菌所使用的CRISPR-Cas3系統。他們表示，該系統符合“最小”類型IC CRISPR-Cas系統的要求。也就是說，它僅利用三個cas基因（cas5，cas8和cas7）來產生可組成Cas3的crRNA導向的Cascade監視復合物。

        研究人員將該CRISPR-Cas3系統用于基因組編輯，并評估了它在銅綠假單胞菌和其他三種微生物中的功能，即大腸桿菌、丁香假單胞菌和肺炎克雷伯菌。他們測試了三種應用：大毒力區域的一步刪除、多重靶向和質粒固化。

        研究人員寫道：“由單個CRISPR RNA引導的DNA切割在銅綠假單胞菌中產生了大規模刪除（7–424千堿基），效率接近100％，而相比之下，Cas9則只產生了小規模的刪除和點突變。Cas3產生了來自編程位點的雙向缺失，可將銅綠假單胞菌基因組減少837 kb（13.5％）。在使用Cascade-Cas3進行編輯時，同源定向修復模板可以有效地指定大的缺失邊界，但Cas9沒有。

        研究人員認為，這種源自銅綠假單胞菌的緊湊型CRISPR-Cas3系統，可作為一種新的工具從細胞基因組中切割出更大的DNA片段，并用于開發新療法以及研究人類和其他生物的疾病以及正常功能的基因編輯。

        Bondy-Denomy說，其他的CRISPR-Cas3系統已經在人類和其他哺乳動物細胞中工作，對于改良的銅綠假單胞菌系統也應該可以實現。

        眾所周知，CRISPR-Cas9集成體可在目標位點快速精確地切除少量DNA。然后可以使用其他方法插入新的DNA。但是，UCSF科學家采用的新型CRISPR-Cas3系統卻有所不同。該系統中的關鍵酶Cas3可快速、準確地去除更長的DNA片段。

        Bondy-Denomy解釋說：“ Cas3就像帶電動機的Cas9一樣，找到特定的DNA靶標后，它就可以在DNA上運行并像吃豆人一樣咀嚼它，與Cas9不同的是，當Cas3精確地與其DNA靶結合時，它開始在兩個方向上咀嚼雙鏈DNA的一根鏈，從而暴露出一條單鏈。”

        在UCSF實驗中獲得的缺失大小不等，在許多情況下包含多達100個細菌基因。研究人員發現，CRISPR-Cas3機制還可使新DNA序列更容易取代缺失的DNA。

該論文的作者補充說：“ CRISPR-Cas3是用于真核細胞的一種特別有前途的工具，因為它將促進對大部分非編碼DNA片段的詢問，其中大部分功能未知。此外，最近發現，Cas9產生的'基因敲除'（即，導致插入框外突變的小indels）經常編碼可能產生蛋白質產物的假mRNA，因此需要采取全基因去除的方法。”

        根據Bondy-Denomy的說法，沒有一種簡單可靠的方法可以刪除細菌中很大的DNA區域，并用于研究或治療目的。他建議說：“現在，不需要做100個不同的小DNA缺失。取而代之的是，可以只刪除一個，然后看看有什么變化。”

        他表示，由于細菌和其他類型的細胞通常用于生產基于小分子或蛋白質的藥物，因此CRISPR-Cas3將使生物技術行業的科學家能夠更輕松地從這些細胞中去除潛在的致病性或無用的DNA。大范圍的細菌DNA廣為人知，其未知的功能在某些情況下對于生存是不必要的。此外，細菌DNA包含從其他來源導入的大片段DNA，這可能導致細菌在人的宿主中引起疾病，或轉移細菌的新陳代謝。

        CRISPR-Cas3還可以在工業、農業甚至人類基因治療應用中將整個基因插入基因組。

        在這項最新的CRISPR-Cas3研究中，通過操縱提供給細菌的DNA序列來修復缺失，研究人員能夠精確設置這些大DNA修復的邊界，而這是CRISPR-Cas9無法完成的。

        Bondy-Denomy先前發現了反CRISPR策略，噬菌體進化為與細菌抗爭，這些策略可能被證明可用于在副作用出現之前阻止用作人類治療劑的Cas酶驅動的基因編輯反應，或用于利用噬菌體去除有害細菌。他說，那些填滿了腸道的東西。除了大腸桿菌和其他幾個物種以外，人們對那里通常居住的1000多種細菌物種知之甚少。

        他總結道：“非模型微生物在遺傳學世界中已被很大程度上拋在了后面，因此我們非常需要開發研究它們的新工具。”